Aspectos celulares e moleculares da resposta imune inata de queratinócitos humanos durante co-cultivo com Trichophyton rubrum

Abstract

O dermatófito Trichophyton rubrum é o maior agente causador de infecções superficiais de pele, cabelos e unhas e utiliza substratos queratinizados como seu principal nutriente. Entretanto, há um aumento de infecções profundas causadas por T.rubrum, principalmente em pacientes imunocomprometidos, diabéticos, e até mesmo em pessoas sem nenhuma imunodeficiência. Apesar de sua importância no cenário clínico, ainda é escasso o conhecimento dos mecanismos moleculares que estão envolvidos na interação fungo-hospedeiro e quais são os genes humanos envolvidos na resposta imune contra as dermatófitos. Os queratinócitos, antes considerados somente células de barreira da epiderme contra microrganismos, são atualmente considerados os principais responsáveis pelo desencadeamento inicial da resposta imune. A partir do perfil transcricional por duplo RNAseq da interação entre queratinócitos humanos HaCat e T.rubrum foram identificados 369 genes humanos diferencialmente expressos. Dentre estes, os genes CSF2, SLC11A1, RNASE7, SERPINE1, FLG e KRT1 apresentaram indução significativa e, portanto, tornaram-se alvos importantes para estudo da resposta imune inata de queratinócitos contra dermatofitoses. O presente trabalho teve por objetivo avaliar o perfil de expressão destes genes durante o co-cultivo de queratinocitos HaCat com T. rubrum. A expressão genica humana foi avaliada por qPCR utilizando diferentes fases de elementos fungicos de T. rubrum (fase conidial e fase germinativa) no co-cultivo. Os resultados mostraram que as fases de desenvolvimento dos elementos fúngicos de T. rubrum interferiram na expressão dos genes avaliados. Dentre eles, o gene CSF2 que codifica a citocina GM-CSF foi o mais induzido, principalmente em 48 h, quando o co-cultivo foi realizado com T.rubrum na fase conidial. Verificou-se também que o uso de conídios inativados estimulou uma resposta menor dos genes de resposta imune quando comparado ao uso do co-cultivo com conídios vivos. A secreção das citocinas pró-inflamatórias IL-8, IL-6, IL-1β e TNF-α também foi quantificada do sobrenadante de queratinócitos durante o co-cultivo com T.rubrum na fase conidial e germinativa, cujos resultados demonstraram que o perfil de liberação destas citocinas também é influenciado conforme a fase do conídio utilizada. A partir dos resultados obtidos, selecionamos o gene CSF2, como foco de estudo dos demais experimentos. Avaliamos através de ensaio de co-cultivo em placas contendo insertos transwell, que a expressão de CSF2 foi dependente da adesão entre fungo-hospedeiro. Para avaliar se a expressão deste gene também era modulada em bactérias, a linhagem Hacat foi desafiada com diferentes concentrações de lipopolissacarídeo bacteriano (LPS). Observamos que a modulação do gene CSF2 de queratinócitos foi menor quando desafiados com LPS, em comparação com o co-cultivo com T. rubrum. Também foi realizada a quantificação da liberação da citocina GM-CSF no sobrenadante do co-cultivo com T. rubrum em fase conidial e no co-cultivo desafiado com LPS por 24, 48 e 54 h. Os resultados mostraram liberação desta citocina somente no co-cultivo com T. rubrum. A fim de avaliar a função do gene CSF2 e da citocina GM-CSF durante o co-cultivo, a expressão do gene CSF2 foi reduzida utilizando uma tecnologia de transmissão de frequências extremamente baixas (co-cultivo ΔCSF2). Os resultados mostraram que o uso destas freqûencias foi capaz de reduzir em até 10 x a expressão de CSF2. Além disso, sob ação das frequências, as células de queratinócitos não se mantiveram viáveis durante o co-cultivo em tempos superiores à 24 h. O sobrenadante coletado do co-cultivo ΔCSF2 também mostrou redução da liberação da citocina GM-CSF. Como conclusão, observamos que a fase de desenvolvimento de conídios de T. rubrum influenciou diferentemente os níveis de expressão dos genes de resposta imune de queratinócitos, assim como o perfil de citocinas liberadas por estas células. Dentre os genes avaliados, o gene CSF2 apresentou maior modulação e demais ensaios demonstraram que sua expressão é dependente da adesão fungo-célula e viabilidade dos conídios de T. rubrum. A redução de expressão deste gene afetou a viabilidade de queratinócitos durante o co-cultivo e reduziu a liberação da citocina GM-CSF. Estes resultados evidenciam a importância de estudos mais aprofundados para avaliar o potencial antifúngico e terapêutico de GM-CSF em dermatofitoses.