Transcriptoma do co-cultivo de macrófagos humanos THP-1 com conídios germinados inativados de Trichophyton rubrum

Abstract

Os dermatófitos são fungos que utilizam substratos queratinizados como principal fonte de nutrientes, acometendo principalmente pele, cabelos e unhas. Dentre os dermatófitos, o Trichophyton rubrum (T. rubrum) é considerado o principal causador de dermatofitoses em todo o mundo. Apesar da maioria das micoses apresentarem caráter superficial, atualmente T. rubrum está causando infecções profundas em pacientes com o sistema imunológico debilitado ocasionando lesões graves e profundas. Assim, torna-se importante compreender o mecanismo de ativação do sistema imunológico do hospedeiro em uma infecção profunda. O presente trabalho teve como objetivo principal caracterizar a infecção profunda provocada por conídios germinados vivos (CGV) e conídios germinados inativados (CGI) de T. rubrum do ponto de vista molecular e celular utilizando o co-cultivo com a linhagem de monócitos/macrófagos humanos (THP-1). Na análise da viabilidade celular dos macrófagos após o contato de CGV de T. rubrum por 24h observamos a liberação de 20% da enzima lactato dehidrogenase, mostrando que 80% dos macrófagos estavam viáveis. No tempo de 24 h observamos também a maior liberação da IL-6, utilizando CGV ou CGI, dado que indica ativação do sistema imune. A liberação da TNF-α, IL-8 e IL-1β foi maior utilizando CGV, no entanto, para IL-2 e IL-12 a liberação foi maior utilizando CGI. O sequenciamento de nova geração da resposta ao co-cultivo CGI de T.rubrum mostrou 83 genes modulados sendo 65 induzidos e 18 reprimidos. A categorização dos genes modulados evidenciou as vias de transdução de sinais, comunicação celular e resposta imune. Foram selecionados 16 genes para serem validados e verificamos que a relação de Pearson foi de 0,98, indicando uma alta correlação entre o RNA-seq e qPCR. Foi observado que a modulação de expressão para todos os genes foi semelhante utilizando CGV ou CGI no co-cultivo. Entretanto, os valores de fold change foram maiores utilizando CGV. Não foi possível comparar o co-cultivo de THP-1 com T. rubrum e estimulado com LPS bacteriano, pois não foi observada a expressão do gene TRL4 (receptor do LPS) no tempo de 24h. Porém, no co cultivo na presença do LPS em 9h verificamos a repressão dos genes ANKRD1 e indução de TLR8, TLR7 e CD1D. Devido à alta expressão do gene IL-32 no RNAseq, quantificamos a interleucina IL-32 e verificamos a liberação no co-cultivo com T. rubrum. Na quantificação da IL-32 também não foi possível comparar com o LPS, devido a diferença dos tempos testados no co-cultivo (9h para LPS e 24h para T.rubrum). Desta forma, podemos concluir que o modelo de co-cultivo de macrófagos com T. rubrum mostrou a capacidade dos macrófagos em modular a resposta imunológica, através do aumento de liberação de citocinas pro inflamatórias e pelo perfil de expressão gênica observado no RNA-seq. Através dos resultados obtidos podemos evidenciar possíveis alvos moleculares expressos nos macrófagos que podem ser explorados através de terapias anti-dermatofitos que envolvam a ativação do sistema imune.